Cell lysis & Plasmid DNA purification

Cell lysis(Alkaline Lysis Method)

 

<실험준비>

  ◇ Sample cell 준비

    ⇒ 실험하려는 cell을 LBA plate에 접종, 도말하고 incubation 시킴 저녁때 colony 하나를 따서

        LBA(liquid)배지에 접종하고, incubation 시킨다. 아침에 cell을 꺼내 centrifuge를 하고 상등액

        (배지)를 조심스럽게 따라버린 뒤, -20 ℃에서 보관한다

  ◇ Solution Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 준비

    ⇒ Solution Ⅰ(P1) ☞ Cell wall(membrane)을 약하게 하는 과정

                                   ⇒ 50mM glucose 10mM EDTA 25mM Tris․Cl(pH 8.0)

        Solution Ⅱ(P2) ☞ Cell wall(membrane)을 부수는 과정

                                   ⇒ 0.2N NaOH 1 % SDS(LAURYL　SULFATE)

        Solution Ⅲ(P3) ☞ 중화
                                   ⇒ 5M KAc(Potassium Acetate) Glacial Acetic Acid

 

     ⇒ 각각의 용액을 500ml씩 만들고 난 후, Autoclave한다.(Solution Ⅰ, Ⅲ는 4℃에서 보관)

 

<실험방법>

1. -20 ℃에서 보관된 sample을 꺼낸 후, P1용액을 10ml 넣어주고, 잘 섞어준다

2. Centrifuge tube로 용액을 옮긴 후, 10ml의 P2용액을 넣어준다

3. Tube의 입구를 막고 5~6번 inverting 한 후에 5분동안 놓아둔다

4. 5 분 후, 다시 10 ml의 P3 용액을 넣고, 3번의 방법과 같은 방법으로 해 준 후에,

    ICE BATH 위에서 5분동안 놓아둔다

5. 5 분 뒤, RPM(10000~13000정도)을 조금 높게 하여 오랫동안(20~30분정도)

    centrifuge 시켜준다

6. Centrifuge가 끝나면, 상등액을 조심스럽게 falcon tube에 담는다

 

 

plasmid DNA purification

1. Kit를 준비한다.(QIAGEN Plasmid Midi/Maxi)

2. QIAGEN-Tip을 Setting하고, QBT buffer로 세척해준다.(10 ml)

3. Cell lysis를 하고 난, 준비된 sample을 세척된 QIAGEN-Tip에 조심스럽게 부어준다

4. QIAGEN-Tip에 다 걸러졌으면, QC buffer를 이용하여 세척해준다.(2 반복)

5. 10 ml의 QF를 넣어준다.(DNA가 빠져나오도록 하는 과정)

     ⇒ 새 튜브를 준비하여 그안에 추출물을 담는다. 이것이 바로 Plasmid DNA 임

6. 7 ml의 Isopropanol을 넣고, 잘 섞어준 후 centrifuge 시켜준다.(15000 g, 30 min, 4 ℃)

     ⇒ Precipitate DNA

7. Centrifuge가 진행되는 동안, 건조할 것(tissue)를 준비

8. 조심스럽게 꺼내어 밑에 가라앉은 pellet을 확인

     ⇒ 잘 안보이므로 투명한 centrifuge tube로 하는게 날 것 같다. 

         아님, Marker를 이용해 check 해 놓던지..

9. 가라앉은 pellet에 유의하여 조심스럽게 상등액을 따라버린 후, tissue 위에 거꾸로 세워

    건조시킨다

10. Dry 후, TE buffer를 1ml 넣어주어 잘 섞어준 후, microtube에 담아 -20 ℃에서 보관한다

     ⇒ 원래의 방법이라면, 70 %의 Ethanol을 이용, 한번 더 세척, centrifuge를 해주어야 하나,

         실험 중 유실될 Plasmid의 양을 고려, 바로 TE buffer를 넣고 실험함