PCR(Polymerase Chain Reaction)의 원리 및 실험방법
PCR이란, 영어 Polymerase Chain Reaction(PCR)의 줄임말로 중합효소 연쇄반응이라 한다.
PCR은 유전자를 증폭하는 방법으로 이미 알고있는 일부의 염기서열중 특정 DNA 부위를 반복 합성하여 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법이다.
이 방법은 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA합성이 가능하므로 분자생물학적으로 제한효소의 발견만큼이나 아주 획기적인 것이라 할 수 있다.
primer 제작하고, PCR을 통해 원하는 부분의 DNA를 선택적으로 증폭시킨 후, electrophoresis(전기영동)라는 것을 통해 Band의 형태로 볼 수 있다. 전기영동은 agarose gel이나 polyacrylamide gel에 PCR 증폭산물을 loading하고, 전류를 흘려주어, 증폭산물이 전류를 따르 흘러, 증폭한 사이즈에 맞는 band의 형태를 확인하는 것을 말한다.
PCR은 보통 25~ 35 cycle로 실시하는데, 30 cycle의 경우 2의 30 제곱만큼의 DAN가 증폭하게 된다. 즉 PCR을 통해 특정 부위의 DNA를 수시간내에 어마어마하게 증폭시킬 수 있으며, 이렇게 증폭된 DNA를 다음과 같이 여러가지 실험에 이용할 수 있고, 실험 결과를 토대로 여러 의학적인 연구에 응용할 수가 있다.
중합효소 연쇄반응이 이용되는 실험
1) Probe로 사용할 목적으로 cloning된 이중가닥 DNA의 증폭
2) 적은 양의 mRNA로부터 특정 cDNA의 cloning
3) DNA sequencing
4) 돌연변이 검사
5) 병인성 바이러스 및 박테리아 검출
6) 유전자의 footprinting
7) 특정 부위에 돌연변이를 일으킨 유전자의 제조(site directed mutagenesis)
중합효소 연쇄반응의 의학적 응용
1) HLA형의 결정
2) 법의학: 특정인의 유전자 검출
3) 암유전자의 검출: ras, myc, fos 등
4) 유전성 질병의 진단: Progressive muscular dystrophy (Duchenne type)등
5) 감염성 질병의 진단: Streptococcus, Salmonella, Hepatitis virus 등
PCR을 하기위한 준비물.
Template DNA : 증폭 대상이 되는 DNA.
한 쌍의 primer : 증폭할 부분을 잡는 짧은 oligonucleotide.
dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) : 유전자를 합성하는 재료가 되는 nucleotide.
Taq polymerase : 유전자 합성효소. 효소이지만 열에 강하다.
PCR 과정
PCR의 과정은 다음과 같이 세 단계로 이루어지게 된다.
1) DNA의 변성(denaturation)
90°C∼96°C로 가열하여 double strand DNA를 single strand DNA로 분리시킨다. 높은 온도일수록 single strand DNA로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성도가 낮아질 수 있으므로 보통 94°C로 쓴다. Cycle의 처음은 확실한 변성을 위하여 약 5~10분정도 시간을 주어야 한다.
2) Primer의 결합(annealing)
50°C∼65°C에서 진행되며, 염기간에 G와 C는 세군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주어야 한다. 일반적으로 사용되는 annealing 온도는 표 1과 같다. 비특이 PCR 산물이 형성되는 경우 결합온도를 올려서 반응시켜 보면 비특이 산물을 줄이는데 도움이 되는 수가 있다.
표.1 Primer 길이와 조성에 따른 annealing temperature
3) DNA의 합성(polymerization)
70°C∼74°C에서 시행하며 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시키는 것이 좋다. Taq DNA polymerase는 보통 1분에 2,000∼4,000 nucleotides를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어날 수 있다. Cycle이 계속되면서 효소 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물은 점점 많이 존재하게 되므로 cycle 후반부에는 반응시간을 조금씩 늘려가는 것도 좋은 방법의 하나이며, 마지막 cycle에는 시간을 충분히(10분) 주어 효소의 활성이 충분히 발휘되도록 한다.
위 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 25∼35회) 원하는 DNA 부분을 증폭시키는 것이 중합효소 연쇄반응의 원리이다.
쉽게 설명하면 튜브에 재료를 집어넣고 뜨겁게 했다가 식혔다가 왔다갔다 하는 것이며, 이 재료 중, Taq polymerase가 유전자를 합성해주는 것이다.
PCR의 원리에 대해서 쉽게 이해하고 싶으신 분들은, 이곳에 가셔서 하나씩 클릭하시면, 그림과 함께, 쉽게 이해하실 수 있으실겁니다!!
외국싸이트라 영어로 나오지만, 뭐.. 그림만 봐도 충분히 이해가 되실 듯~~!!^^
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/shockwave/pcranwhole.html
PCR 실험 방법
1. PCR실험을 위해 필요한 시약 및 용액, Sample을 준비한다.
(Buffer, Primers, Marker, DNA, Enzyme, dNTP(Nucleotides), BSA, MgCl2)
⇒ 보통 -20℃에서 보관하므로 실험시작 10분전쯤에 꺼내어 놓고 녹인다.
2. Ice를 준비하고, 녹은 시약 및 sample을 vortex 시켜준다.
3. Ice 위에서 조성표에 따라 buffer 용액을 만들고, PCR tube에 각각의 sample을 오염되지 않도록 잘 넣어준다.
<조성표>
<100ul당>
10X buffer 10㎕
50 mM MgCl2 3㎕
dNTP(nucleotides) 10㎕
BSA 1㎕
10uM Primer (A) 2㎕
(B) 2㎕
DNA 2~4㎕
Taq polymerase 0.5㎕ (2.5unit)
H2O (S.D.W) ( ) to 100㎕
⇒ DNA sample의 경우에는 PCR tube에 각각 오염되지 않도록 조심스럽게 넣고,
Taq polymerase는 Enzyme이므로 냉장고에 보관하였다가 다른 용액을 다 섞고
난 후에 냉장고에서 꺼내어 넣어주고, 다시 한번 잘 섞어준 후 사용한다.
☆ 생각해 볼 점!!
⇒ 그때그때 상황에 맞게 조금씩 변화될 수 있다.
DNA의 양이 많을경우와 적을경우에 따라 조금씩 변화될 수 있다.
DNA의 Concentration이 보통의 경우(DNA concentration이 높을경우)에는 2㎕를
넣으나, DNA concentration이 낮을 경우에는 조금 더 넣어줄 수 있다.(4㎕)
4. 뚜껑을 닫고, 두 세번 흔들어 준 후, PCR을 할 준비를 한다.
5. PCR을 켜고, setting한다.(예)
⇒ 94℃ : 5분
Step 1 : 94℃(40초)
⇒ Primer, dNTPs, DNA polymerase가 들어간 반응액중에 목적으로 하는 두가닥
의 DNA를 열변성한다.
Step 2 : 55℃(40초)
⇒ Annealing Temperature : 열변성에 의해 생긴 한가닥 Template DNA에
Primer를 annealing한다.
Step 3 : 72℃(1분 40초)
⇒ Elongase Temperature : DNA polymerase에 의해 상보적으로 DNA가 합성된
다. 증폭 산물로써의 두가닥 DNA를 재열변성하여 한가닥 DNA를 형성한다.
< Step 3 후, Step 1 으로 되돌아감 >
☆ Step 1~3을 1 cycle로 하여 25~30cycle을 반복한다. 보통의 경우 25~30cycle을 하나
DNA의 조건에 따라 설정조건이 달라질 수 있다. (DNA의 크기, Concentration)
72℃(7분) ⇒ Cycle이 끝나고, 혹시 모를 결합이 미숙한 DNA를 완전하게 합성시켜준다.
4℃(∞)