분자생물학 공부:PCR의 응용

PCR(중합효소 연쇄반응)을 처음 고안해 낸 Kary Mullis가 이 방법의 발표 후 17년만인 지난 1992년 노벨 화학상 수상자로 선정되었는데, 선정 사유는 특정 DNA의 증폭 방법을 고안함으로써 과학발전의 획기적인 계기가 되었다는 것이었다. 이를 구체적으로 설명하자면 연구하고 싶은 유전자는 무엇이든 대량 생산이 가능하게 되었다고 할 수 있으며, PCR 방법을 응용하면 새로운 여러가지 기술개발이 가능해졌다는 이야기가 된다. 새로 개발된 실험방법이 소개되는 Nucleic acid research와 같은 잡지에는 PCR을 응용한 새로운 실험방법이 매회 거의 빠짐없이 발표되고 있다. 많이 사용되는 방법 중에는 RT-PCR(reverse transcriptase PCR), SSCP(single strand conformation polymorphism), RACE (rapid amplification of cDNA ends), ISPCR(in situ PCR), DDRT-PCR(differential display reverse transcriptase PCR) 등이 있는데, 간단한 원리만 소개하겠다.

I. RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)

특정 부위의 RNA를 template로 하여 이에 상응하는 cDNA(complementary DNA)를 합성한 다음 이를 이용하여 PCR 증폭을 시행하는 기술이며, 실험과정은 1) 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 제조하는 과정과 2) cDNA를 이용하여 특정부위를 증폭시키는 과정으로 나뉘어지며, (2) 과정은 genomic DNA로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 방법과 같다. 이 방법은 Northern blot hybridization과 같은 방법을 통해 가능하던 RNA 분석보다 실험방법이 더욱 간단할 뿐 아니라 유전자의 염기서열 결정이 가능하기 때문에 주로 mRNA의 염기서열 및 전사량을 연구할 때 크게 도움이 된다. 염기서열이 알려진 유전자의 경우 RT-PCR을 통해서 전체 길이의 cDNA를 간단하게 합성하여 cloning 할 수 있다.

 

실험방법

1. 다음과 같이 시료를 혼합한다.

            RNA 11 μl
            Random nomamer 1 μl

#. Total RNA는 1~5 μg, mRNA는 50~500 ng을 쓰면 되는데, 보통 1 μg의 total RNA로 충분하다. RNA의 분리는 이 책의 다른 장에 기술되어 있는데, 요즘에는 간단히 RNA를 분리할 수 있는 kit가 많다. 어떤 kit로 분리하든 관계없으나, RT-PCR에 이용할 경우 DNA의 contamination이 있지 않도록 주의하여야 한다. 실험자에 따라서 DNase I을 처리하여 사용하는 사람도 많다.

#. Primer는 oligo(dT) primer, random primer, 또는 gene specific primer를 사용할 수 있다. 보통의 경우라면 random primer를 권한다. Random nomamer 또는 random hexamer는 Bioneer 사 등에서 합성(염기서열 5'-NNNNNNNNN-3'으로 주문)하여 사용한다. 50~250 ng을 이용하면 되는데, 대개 100 ng/μl로 희석해 놓고 1 μl 씩 반응에 이용한다. 사용 전 25°C 또는 상온에 10분 두었다가 쓴다.

2. 70°C에 10분 두었다가 곧바로 얼음에 옮긴다. 간단히 원심분리하여 바닥에 시료를 모으고 다음과 같은 시약을 첨가한다.

            5x first strand buffer 4 μl
            0.1 M DTT 2 μl
           10 mM-each dNTP 1 μl 
           Superscript^TM II (200 units/μl) 1 μl

#. 이 과정은 첫번째 가닥의 cDNA를 만드는 역전사 과정으로 reverse transcriptase(RT)를 요한다. 이 효소는 AMV-RT, MMTV-RT 등이 있는데, superscript II는 cDNA의 합성을 보다 효율적으로 할 수 있고 RNase가 오염되지 않은 RT로 Gibco 사에서 구입할 수 있다.

3. 42°C에서 50~60분 반응시키고 70°C에서 15분 두어 효소를 불활성화 시킨다. 대부분의 경우 이 반응물을 2~10 μl template로 하여 직접 PCR 반응에 이용할 수 있다. 그러나 PCR 하고자 하는 gene의 크기가 1 kb 이상인 경우에는 다음 과정을 첨가하는 것이 좋다.

4. E. coli RNase H(2 units/μl) 1 μl를 첨가하고 37°C에서 20분 반응시킨 후 phenol/chloroform extraction 또는 QIAquick column 등을 이용하여 purification한다.

5. 과정 3 또는 과정 4의 반응물을 template로 하여 PCR 반응을 시행한다.

II. SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)

어떤 입자들의 전기장 내에서의 이동속도는 그 입자의 크기와 형태에 영향을 받는다. Single strand DNA는 non-denaturing 조건하에서 분자내의 상호작용에 의하여 2차 구조를 형성하게 되는데 이 2차 구조는 DNA의 염기서열에 의하여 결정돤다. 그러므로 DNA 염기서열중 하나의 염기서열의 변화(point mutation, deletion 또는 insertion)에 의해서도 전기영동상 전개되는 속도에 영향을 받으므로 이동거리에 차이가 발생하게 된다. 이와 같은 원리를 바탕으로 1989년 Orita 등에 의하여 고안된 SSCP는 유전자의 돌연변이를 검색하는 유용한 도구로서 사용되고 있다.

최초의 SSCP 방법은 genomic DNA를 적당한 제한효소로 절단하고 alkali로 denaturation시킨 후 non-denaturing polyacrylamide gel에서 전기영동한 다음 이를 nylon membrane에 transfer하여 fragment DNA를 옮겨 놓은 후 방사성 동위원소로 표지된(radiolabeled) RNA 혹은 DNA probe를 이용하여 autoradiography를 실시함으로써 X-ray film에 나타나는 정상 유전자와 변이된 유전자와의 전개거리의 차이를 확인하여 돌연변이를 검색하였다. 그러나 그 후 PCR 산물을 SSCP로 분석하는 방법이 소개되었고, 이 방법이 대중화됨에 따라 요즘은 PCR-SSCP라는 용어로 많이 불리어지고 있다. 최근까지는 PCR-SSCP를 할 경우 PCR 산물에 직접 동위원소를 표지하여 autoradiography를 통해 결과를 얻는 방법이 많이 이용되었으나 최근에는 silver staining으로 polyacrylamide gel을 검색하는 방법이 소개되어 현재 이 방법이 유용하게 이용되고 있다. Silver staining 방법은 방사성 동위원소를 사용하지 않고도 훨씬 더 빠른 시간에 PCR 산물을 분석할 수 있는 장점이 있으며 민감도(sensitivity)에는 방사성 동위원소를 이용한 방법과 별 차이가 없으므로 더욱 편리하고 안전하게 실험을 진행할 수가 있게 되었다.

III. RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)

cDNA를 cloning하기 위해서는 cDNA library를 screening하는 방법이 현재 가장 일반적이라 할 수있지만, 이 방법으로 처음 screening을 하여 찾아낸 clone은 대개 전체 cDNA의 일부이며 계속 반복하여 screening을 하여야만 완전한 cDNA를 얻어낼 수 있다. 그러나 이런 과정은 대단히 시간과 노력이 소모되는 작업이며 유전자 자체가 cDNA library에 적은 양으로 존재하는 경우는 더더욱 힘든 일이 될 것이다. 또한 initiation codon부터 termination codon까지 open reading frame(ORF)을 완전히 결정한 경우에도 cDNA의 5'과 3'-끝의 non-coding region 일부는 library screening에서 얻기가 어렵다. 이러한 문제를 해결하고자, 1988년 Frohmann 등은 다음과 같은 방법을 소개하고, 이를 RACE(rapid amplification of cDNA ends)라 이름하였다. 즉, cDNA의 일부 염기서열을 알고 있으면, 이 부분에서 gene specific primer를 합성하고 PCR reaction을 통해 5' 혹은 3'-end 까지의 DNA를 증폭하는 것이다. 3'-RACE에서는 mRNA의 3'-end에 존재하는 poly(A) tail을 이용할 수 있으므로, down stream primer로 oligo-(dT) primer를 쓴다. 그러나, 5'-RACE의 경우는 gene specific primer로 합성한 1st single strand cDNA의 끝에 TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 사용하여 poly(A) 혹은 poly(C) tail을 인위적으로 만들어 주어야만 한다.

IV. ISPCR(In Situ Polymerase Chain Reaction)

PCR은 원하는 DNA를 대량으로 증폭시키는 방법이고, in situ hybidization (ISH)은 세포나 조직에 존재하는 극미량의 DNA 및 RNA를 찾아낼 수 있음은 물론 원하는 유전자들의 위치까지 확인할 수 있는 방법이다. ISPCR은 이 두 가지 방법의 장점을 혼합하여 응용한 방법으로서 PCR의 sensitivity와 ISH의 specificity를 고루 갖추고 있다. ISPCR의 실험원리는 일반적인 PCR 방법과 같으나, slide glass 등의 사용에 적합한 ISPCR용 기구가 필요하며 사용하는 기구에 따라 반응시키는 방법들이 다양하게 제시되어 있다.

ISPCR은 세포내의 target sequence를 증폭시키는 것으로부터 반응이 시작되며 세포막을 통해 여러 물질(예: PCR 용액에 들어 있는 salt 등)들이 쉽게 이동할 수 있도록 세포막을 HCl, proteinase K 또는 Triton X-100 등으로 처리해 주는 과정을 거쳐야 한다. 이 과정에 이상이 생기면 세포가 손상되거나 파괴되는 수가 있으므로 PCR이 끝난 후에 세포 안에서 증폭된 PCR 산물이 세포 밖으로 빠져나오는 원인이 되기도 한다. 그러므로 적당한 세제의 적절한 선택과 사용이 무엇보다 중요하며 PCR 산물이 세포 밖으로 유출되는 것을 막기 위해서는 single primer pair with complementary tail, biotinylated dNTPs, multiple overlapping primer pair 등을 이용한 방법이 소개되어 있다.

현재까지 ISPCR 방법의 효율은 그다지 높지 못한 것으로 알려져 있으며 specificity를 증가시키기 위해서는 DNA probe를 이용한 in situ hybridization을 시행하거나 Southern blot hybridization을 시행하는 것이 좋은 방법이 된다. 효율이 별로 높지 못한 방법임에도 불구하고 ISPCR에 대한 관심이 최근 크게 증가하고 있는 것은 여러 가지 질병들의 조기 발견에 큰 도움을 받을 수 있을 것으로 기대되기 때문이며, 지금도 여러 회사에서 ISPCR에 유용한 기구들을 제작, 판매하고 있으나 더 좋은 기구의 개발이 이루어져 효율을 더욱 높일 수 있다면 ISPCR이 더욱 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

V. DDRT-PCR(Differential Display Reverse Transcriptase PCR)

일반적으로 고등동물에서는 약 100,000가지 정도의 서로 다른 유전자가 발현되고 있으며 각각의 세포 한 개에서는 이중 약 15%만이 발현되고 있다. 발생, 분화, homeostasis, 세포주기 조절, 노화, 발암과정 및 세포의 퇴화 등의 과정에서 표현되어 나타나는 유전자들은 전체 유전자들 중에서 일부가 선택되어 나타나는 것이라고 할 수가 있다. 특정 세포에서 발현되는 특정 유전자들을 찾아내기 위하여 주로 사용되는 방법은 subtractive hybridization 또는 differential hybridization 방법이었으나 최근 PCR을 이용하여 유전자를 찾아내는 방법(DDRT-PCR)이 개발되었다.

DDRT-PCR이란 서로 다른 세포로부터 RNA를 분리한 후 특정하게 발현되는 mRNA를 찾아내기 위하여 T 염기 10개와 비특정염기 2개가 연결된 oligonucleotide를 primer로 이용하여 cDNA를 합성한 후 이 primer와 비특정 염기서열을 지닌 oligonucleotide를 primer로 이용하여 PCR 하였을 때 나타나는 여러가지 PCR 산물을 비교함으로써 서로 다른 세포로부터 증폭된 PCR 산물에 차이가 있는지 없는지를 확인하는 방법이다. 서로 다르게 증폭된 PCR 산물을 선택하여 이와 같이 증폭된 DNA가 특정 세포에서 특징적으로 발현되는 유전자인지를 보는 것으로 subtractive hybridization보다 방법이 훨씬 간단한 것이 장점이지만, 실험의 sensitivity와 specificity가 낮은 것이 단점이다. 최근 이 방법에 대한 연구가 많이 진행되면서 새로운 더 좋은 방법들이 계속 발표되고 있으므로 최신 논문을 참고로 적절한 조건을 찾아내어 실험을 시행하면 좋은 결과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.