PCR 수행시 각각의 성분에 대해 주의할 점.

1. Template DNA

선택하여 증폭하고자 하는 target DNA 단편을 가리키는 용어로서 세포내의 chromosomal DNA나 전염성 병원체의 DNA 또는 RNA로부터 제조한 complementary DNA(cDNA), plasmid DNA 등을 쓸 수 있다. 불순물이 섞여 있으면 반응을 억제할 수 있으므로 가능한 한 정제하여 사용하는 것이 좋으며, 정제가 안된 경우에는 양이 적을때 반응이 충분히 일어나지 않고 양이 많으면 비특이적 반응이 일어나므로 주의해야 한다.
Chromosomal DNA인 경우 1 μg 이내, plasmid DNA의 경우 100 pg∼100 ng 정도를 일반적으로 사용하지만 사용하고자 하는 DNA 내에 증폭하고자 하는 target DNA의 copy 수에 따라 달라질 수 있다. 전기영동상에서 비특이 DNA가 나타나거나 끌린 모양이 나타나면 맨 먼저 template DNA양을 줄이는 것을 시도하는 것이 좋다.

 

2. Primer

Template DNA 가운데 선택적으로 증폭시키고자 하는 target DNA 단편의 양쪽 끝에서 안쪽으로 약 20 bp 내외의 염기서열에 대응하는 oligonucleotide를 DNA 합성기로 합성하여 이용한다. G+C 비율이 반 정도 되게 디자인하는 것이 primer와 template 간의 결합력을 강하게 유지하는데 도움이 되며 G+C 함량이 많을 경우에는 annealing 온도를 높이면 되지만, 무엇보다도 양쪽 primer의 annealing 온도를 비슷하게 만들어야 한다. 또한 양쪽 primer가 서로 상보적인 염기 결합이 일어나지 않도록 하고 가능하면 반응산물내에 있는 DNA 염기서열을 분석하여 비특이 DNA가 생성되지 않도록 고안해야 한다. Primer의 디자인이 PCR 반응의 성공 유무의 90%를 차지한다고 할 수 있기 때문에 합성하기전에 신중히 고려해야 할 것이다. Primer 합성은 염기서열을 적어 바이오니아(구 한국생공) 등의 회사에 의뢰하면 주문에 따라서 정제도 해준다. 정제는 Sep-pak, OPC나 PAGE 정제를 이용하는데, 가능하면 PAGE 정제된 primer를 쓰도록 한다.
Primer의 양은 0.1~0.5 μM로 시행한다.

 

3. dNTP (deoxynucleotide triphosphate)

시약상에서 dATP, dCTP, dGTP와 dTTP(각각 100 mM stock)을 구입한 후 혼합하여 사용한다. 양은 target DNA의 길이에 따라 다를 수 있으나 각각 20∼200 μM 정도를 사용한다.

 

4. 10x PCR 완충용액

1) Magnesium

다음과 같은 여러가지에 영향을 주는 중요한 요소이다.
A, Primer가 template DNA에 결합하는 능력
B. Template 및 PCR 산물의 변성온도
C. Product specificity
D. dNTP와의 결합
E. Taq DNA polymerase의 활동성
F. Primer-dimer artefact의 형성

a) 반응물내에 EDTA와 같은 chelator가 포함되면 농도를 올려 주어야 하고, dNTP나 template의 농도가 높으면 MgCl₂의 농도를 높게 변화시켜야 한다.

b) 위에 나열한 Mg의 기능중 A, B, C, D는 농도가 높을수록 실험에 유익하고 E, F는 농도가 낮을수록 실험에 유익하므로 최적 농도를 유지할 수 있도록 노력해야 한다.

c) 반응이 잘 일어나지 않으면 0.5 mM부터 2.5 mM(때로는 8 mM까지)사이에서 농도를 변화시켜 가면서 최적조건을 찾도록 한다.

 

2) KCl

Primer가 target DNA에 결합하는 것을 도와주며, Taq DNA polymerase의 반응율을 높여준다.

3) Gelatin 또는 bovine serum albumin(BSA)

Taq DNA polymerase를 안정화한다.

일부 보고에 의하면 반응완충용액내에 KCl이나 gelatin, BSA 등을 첨가하지 않는 것이 더 좋다는 설도 있다.

 

5. Taq DNA polymerase
Taq는 온천에서 사는 Thermus aquaticus라는 균주에서 따온 이름이다. 이 균의 활동 적정온도는 70°C∼74°C이며 95°C에서 40분이 지나도 50% 정도의 활성은 남아 있다. 이 효소가 발견되기 전에는 Klenow 효소를 이용하여 매 cycle마다 효소를 첨가해 주면서 반응을 시켜야만 했다.

DNA 합성의 오차율은 1.1×10^-4 bp로 DNA polymerase I의 오차율(1.0×10^-5)보다 높는데 이는 Taq DNA polymerase가 잘못 들어간 nucleotide를 삭제하고 다시 합성하는 proofreading 기능(3'→5' exonuclease activity)이 없기 때문이다. 따라서 PCR 산물에서 유전자의 변이가 발견되더라도 반드시 확인과정을 거쳐야 한다.

한번의 반응에 사용하는 효소의 양은 보통 0.5-5 unit 정도인데 양이 너무 많으면 비특이 적인 DNA가 형성될 가능성이 많고, 너무 적으면 증폭 산물이 부족하게 되므로 최적 조건을 찾도록 노력해야 한다.