식물영양학 실험 - ARA test

우리는 N2가 NH3의 형태로 바꾸어지는 것을 질소고정이라 부른다.

그러나 우리는 직접적으로 이 과정을 알아볼 수 있는 방법이 없다.

따라서, 우리는 간접적인 방법으로, Acetylene을 이용하여 알아볼 것이다.

Acetylene은 환원되면, Ethylene의 형태로 바뀐다.

즉, 삼중결합의 형태에서 이중결합의 형태로 환원이 되는 것이다.

따라서, Acetylene gas를 넣어주었을 때, 바뀌어지는 Ethylene의 양을 보고, 그 양이 얼마만큼 생성되어졌느냐를 보고, 알아보는 것이다.

 

N≡N + 8H+ + 8e- ⇒ 2NH3 + H2 : N-fixation

C2≡H2 + 2h ⇒ C2H4 : Acetylene reduction

RC≡N + 6H+ + 6e ⇒ RCH3 + NH3 : Cyanid detoxification

 

 

Acetylene reduction activity(ARA)

 

1. Nfb 배지를 petridish에 넣고 굳힌 후, 준비된 균주에서 colony 하나를 떼어내어 streaking 한다.

2. Incubator에서 72시간 배양한다.

3. Nfb배지(or NB배지)를 준비한다.

4. Plate에 잘 자란 colony중 하나를 떼어내어, Nfb배지에 넣고, 30℃, 150 rpm에서 48시간동안 배양한다.

5. Microtube를 멸균하고 배양이 다 된 균주를 incubator에서 꺼내 microtube에 넣고, centrifuge 시킨다. (4800g, 30min) (개체수가 얼마 안될경우, 균주를 더 넣어 원심분리를 더 시킨다.)

6. Centrifuge가 끝나면, 다시 Sterile saline solution(0.85 g/L NaCl)을 이용, microtube에 넣고 가라앉은 균주와 잘 섞어주고, 다시 한번 원심분리 해준다.

7. Centrifuge가 끝나면, 같은 방법으로 Sterile distilled water(SDW)를 1ml 넣어주고, 잘 섞어주어 현탁액을 만든다.

8. 40ml의 Nfb semisolid 배지를 넣은 GC bottle(120ml volume)을 준비, 그 bottle에 0.1ml의 현탁액 을 넣고 마개를 덮은 후, 24h동안 배양한다.(30℃)

9. 마개를 빼고, rubber serum stoppers로 바꿔 막아준다.

10. 10%의 Acetylene gas를 넣어준다. ⇒ 먼저 8ml의 공기를 빼준 다음 8ml의 Acetylene gas를 넣어준다.

11. 24시간동안 incubation시킨다.

12. Gas chromatograpy를 이용하여 측정한다.

     < C2H2(Acetylene) ▷▷▷ C2H4(Ethylene) >