환원당 정량법(DNS 환원당 정량)

환원당 정량법

 

 

 

DNS 환원당 정량

 

 by UV-Vis Spectrophotometer)

 

 

DNS 환원당 정량 방법은 환원당(reducing sugar)을 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)와 Rochelle 염으로 발색하여 흡광도를 측정하는 환원당 정량법이다. 이 방법은 조작이 간편하면서도 저렴하게 원하는 결과를 얻을 수 있어 널리 사용되고 있다.

saccharides(당류)에 free carbonyl group (C=O)가 있으면 환원력이 나타난다. 이러한 환원력을 이용하여 발색시약인 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS)를 알칼리 조건에서 환원시키면 이 DNS는 3-amino-5-nitrosalicylic acid로 환원되면서 540 ~ 575 nm 범위의 빛을 흡수하여 된다. 이렇게 발색되는 정도는 시료에 존재하는 환원당과 정량적으로 비례하며 UV-Vis Spectrophotometer를 이용하여 발색되는 정도를 Absorbance(흡광도)로서 측정하여 정량분석을 할 수 있게 되는 것이다.

DNS(3,5-Dinitrosalicylic acid)는 환원당을 측정하는데 사용하는 시약이며 설탕자체는 비환원당으로 환원당이 아니라 DNS로 측정을 할 수 없으나 이 설탕이 가수분해되면 포도당, 과당 따위가 생성된다고 한다. 즉, 탄수화물은 단당류, 이당류, 다당류로 나뉘며 단당류와 이당류 중 알데히드기(R-CHO)와 케톤기(R-CO-R')의 존재에 따라 환원성이 있는 환원당과 환원성이 없는 비환원당으로 나누어진다. 환원당은 반응성 있는 알데히드기, 케톤기를 갖고 금속염 알칼리용액을 환원시키는 성질이 있는 당의 총칭이다. 포도당(glucose), 과당(fructose), 맥아당(maltose), 유당(lactose), 갈락토스(galactose) 등이 포함된다.

설탕과 전분 등과 같이 다른 물질을 환원시키지 못하는 당을 비환원당이라고 하는데, 설탕은 비환원당이지만, 산과 함께 가열하면 포도당과 과당으로 분해하므로 환원력이 생긴다.

DNS 환원당 정량 방법은 흡광도를 측정하여 물질을 정량분석하는 것으로, 흡광도는 전자전이에 따라, 흡수물질의 농도에 따라 다르게 나타나기 때문에 이를 이용하여 물질을 정량 분석할 수 있다.

즉, 환원당을 함유한 시료를 제조하여 시료가 든 시험관에 DNS 시약을 넣고 물중탕한 후, 냉각시키면 발색반응이 일어나면 흡광도를 측정한다. 미지시료 용액의 흡광도와 표준용액의 흡광도를 비교하면 흡광도에 따른 농도를 구할 수 있게 된다. 흡광도는 농도가 증가함에 따라 증가하게 된다.

 

1. 실험재료 및 시약

표준 당 용액 : D-glucose(1.0 mg ml-1), DNS reagent, D.W

분석기기: UV-Vis Spectrophotometer, 중탕기, test tube 30개, 은박호일, pipette, vortex mixer.

2. 실험방법

1. DNS reagent와 D-glucose 용액 40 ml를 제조한다.

Reagent	L-1
3,5-dinitrosalicylic acid	7.5 g
Sodium hydroxide(NaOH)	14 g
Rochelle salt(Potassium sodium tartrate)	216 g
Sodium bisulfite(Sodium metabisulfite)(Na2S2O5)	5.9 g
phenol	5.4 ml

 

2. test tube와 test tube rack을 준비하고, 각 tube에 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10의 숫자를 적고,

rack에 세운 후, 적어 넣은 숫자에 맞는 양의 glucose solution을 넣어준다.

 

3. D.W를 이용하여 make up을 수행한다.(total 10 ml)

 

4. vortex mixer 기계를 이용하여 Vortex 한다.

 

5. 측정하고자 하는 unknown sample과 은박호일을 준비한다.

⇒ 미지의 시료를 D.W(증류수)를 이용하여 알맞게 희석(10, x100, x1000배)한다.

 

6. 새로운 test tube를 준비하여 sample labeling을 하고, 각각 2 ml씩 DNS시약을 첨가한다.

 

7. 2 ml의 DNS reagent가 담긴 test tube에 glucose를 농도별로 첨가한 standard solution과

unknown sample을 2 ml씩 정확하게 옮겨준다.

 

8. Vortex mixer 기기를 이용하여 tube안에 용액들이 잘 섞이도록 vortex 한다.

 

9. 은박호일을 이용하여 test tube의 입구를 막고 중탕기기에 약 10 min 동안 중탕한다. 이 때,

중탕이 끝나면 바로 찬물에 옮겨 냉각한다.「∵ 미열이 남아 있으면 계속 반응할 수 있기 때문」

 

10. UV-Vis Spectrophotometer를 켜고 sample 측정할 준비를 한다.

⇒ prepare the cuvette, Turn on the D2 lamp, input the wave length, check the base line,

waste bottle, tissue, D.W, blank test)

 

11. 완전히 식힌 test tube sample을 cuvette에 넣고 575 nm의 파장에서 Absorbance(흡광도) 값을

측정한다.

 

12. standard solution을 이용하여 standard curve를 구하고, standard curve에서 나온 식을 이용

하여 unknown sample의 농도를 계산한다.

 

※ DNS method 실험시 유의 사항 및 참고사항

DNS method는 방법이 간단하여 많이 사용하지만 산화 정도가 생성된 dextrin의 사슬 길이에 따르기 때문에 효소 활성이나 환원당의 양이 과대평가 될 수 있는 문제점이 있다. DNS method에서 당은 알칼리 조건에서 발색시키는데, 그 이유는 환원성 말단에 반응을 일으켜 D-Glucose가 D-Gluconate로 바뀌는 것을 측정하기 위해서이다. 그러나, 이렇게 하게되면 단당류, 이당류의 구분 없이 환원성 말단의 개수만큼 반응하게 되기 때문에 오차가 발생할 수도 있다. 다시말해, DNS method는 비특이적이기 때문에 모든 reducing compound와 반응 한다고 할 수 있다. DNS solution에 대해서 살펴보자면, Rochelle salt라는 것을 넣어주는데, 이 물질은 DNS solution을 제조시에 산소가 용해되어 들어가는 것을 방지하기 위해 넣어준다. 산소가 용액으로 녹아 들어가게 된다면 환원당이 산화되기 때문에 측정이 정확하지 않을 수 있기 때문이다. Phenol은 색깔의 양을 증가시키기 때문에, 발색이 더 잘되게 하기 위해 넣어주며, Na-metabisulfite는 색의 안정화에 기여하기 때문에 넣어준다. DNS method는 흡광도 측정 실험이기 때문에 색이 고르지 못하면 실험에 오차를 일으킬 수 있기 때문에 꼭 필요하다.

 

※ Glucose oxidase method

이 방법은 주로 소화율을 확인할 때 많이 쓰인다. Glucose는 glucose의 작용에 의해 α형에서 β형으로 빨리 변하며, 산화되어 gluconic acid와 H2O2가 생성된다. 이 생성된 H2O2는 peroxidase의 작용에 의해 4-aminoantipyrine과 phenol을 산화 축합시켜 적색의 quinone을 생성한다. 이 생성된 quinone 색소의 흡광도를 505nm에서 측정한다.