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미생물 & 유전공학 관련 principle & method

Pulsed field gel electrophoresis(PFGE) & Electrophoresis(CHEF)

Pulsed field gel electrophoresis(PFGE)

 

< 실 험 준 비 >

⇒ Bacteria sample, Plug mold, TE buffer, lysis buffer, TE buffer, 0.1% N-lauroylsarcosine-EDTA, 0.1% Incert agarose

1. Plug 만들기 ⇒ Design ⇒ 10개 → Low density 10개 → Low density + S1 10개 → High density 10개 → High density + S1 ☞ 1.6%의 Incert agarose 만들기 Test tube를 준비하고, Incert agarose 0.048g과 3ml의 SE buffer를 넣어주어 mealting 시켜준 후, 항온수조(55℃)에서 잠시 보관한다.

2. 37℃에서 배양되어진 Sample(Desulfido bacterium)을 Centrifuge 한다.

3. Centrifuge 후 상청액을 조심스럽게 따라버리고, SE buffer 5ml를 넣고 suspension 시켜준다.

4. 마개가 있는 New tube 2개를 준비한다. ⇒ High density : 3ml cell suspension Low density(5배 희석) : 0.6ml cell suspension, S.D.W 2.4ml

※ 남은 cell suspension 용액 중, 1ml를 microtube에 담아 나중에 protein assay에 사용한다. -20℃에서 보관.

5. 55℃에서 보관하던 Agarose와 Cell suspension 용액을 잘 섞어준다.

6. Plug mold를 준비하고, 그 안에 넣어준다.

7. Lysis buffer를 만든다. 30mM Tris 5mM EDTA 50mM NaCl(pH 8.0) containing → 2mg/ml lysozyme(Sigma) 10 unit.ml mutanolysin(Sigma) ⇒ 1회 실험당 5ml씩 넣어준다. 이틀간에 걸쳐서 처리해야 하므로 넉넉히 40ml를 준비한다.

8. Plug의 gel이 다 굳었으면 조심스럽게 빼내어 tube에 처리에 맞게 넣어준다.

9. 37℃에서 18시간 incubation 시켜준다. <하루 경과 후>

10. TE buffer 만들기(pH 8.0) ⇒ 50mM Tris 1mM EDTA

11. Incubater에서 tube를 꺼내어, 용액을 조심스럽게 따라버리고, TE buffer 5ml를 넣고 세척해준다.

12. ICE BATH를 준비하고 tube에서 세척한 TE buffer를 따라버린 후 다시 3ml정도의 TE buffer를 넣고, ICE BATE에서 30분 동안 놓아둔다.

13. 어제 했던 과정을 반복하고 37℃ incubator에서 18시간 배양한다.

14. TBE buffer(5X)와 0.1% N-lauroylsarcosine-EDTA(50nM, pH 9.5)를 만든 후, Autoclave 한다. <하루 경과 후> ※ 실험전 준비 ⇒Water Bath를 56℃로 setting 시켜주고, ICE를 준비한다.

15. 어제 incubation 시켜 두었던 Plug gel을 꺼내어 어제와 같은 방법으로 다시한번 Wash 해 준다. ⇒ TE buffer를 이용하여, High density와 Low density의 Plug gel을 씻어주고, 잘 따라 버린 뒤 다시 5ml의 TE buffer를 넣고 30분간 ICE BATH 위에서 놓아둔다.

16. 30분의 시간이 경과할 동안, 어제 만들어 놓은 0.1% N-lauroylsarcosine-EDTA를 준비하고, 10ml를 따서 5mg의 Proteinase K와 섞어 줌.(0.5mg/ml)

17. 30분 경과 후, TE buffer를 조심스럽게 따라내고, 16번에서 만든 용액을 5ml씩 넣어준다.

18. Water bath(56℃)에서 두 Tube를 넣고 Overnight 시킨다.

 

Electrophoresis(CHEF)

◈ 준비물 ☞ Gel templete, Pulsed Field Certified Agarose(Bio RAD), TBE buffer(0.5X) 2L, Alchol, 칼, 유리판, 핀셋 혹은 숟가락 2개, 삼각 플라스크, CHEF MAPPER(BIO RAD), Sample, Marker(Sample과 Marker는 냉장실(-4℃)에서 보관)

19. Gel 만들기 ⇒ 0.5X TBE buffer 100ml와 1g의 Agarose(Pulsed Field Certified Agarose) 용액을 넣고 전자렌지를 이용하여 melting시킨 후 gel templete에 comb를 꽂고 용액을 부어준 후 식힌다.

20. 기계를 setting한다.

㉠ CHEF Gel box에 0.5X TBE buffer를 약 2L정도 넣어준다. → 예전에 남아있는 용액을 제거해주고, 새로 만든 용액을 넣어준다.

㉡ CHEF MAPPER의 pump switch를 켜고, circulation 시켜준다. → Gel을 넣기 전, circulation을 시켜줘서 호스내의 공기를 다 빼준다. 호스에 남아있는 공기방울을 손가락을 이용, 톡톡 쳐서 다 빼내어준다. ∵ 기포가 있으면, 호스가 얼 염려가 있기 때문에..

㉢ Cool Module을 켜고 온도를 14℃로 setting 시켜준다. → 다소 시간이 걸리므로 미리 준비, 혹은 켜고 sample을 준비하는게..

21. Gel이 다 굳었으면 조심스럽게 comb를 빼고, sample과 marker를 넣어준다.

㉠ 유리판과 숟가락, 칼을 알콜을 이용하여 잘 닦아준다.

㉡ Sample을 냉장실에서 꺼내와 유리판에 놓고 알맞은 크기로(홈에 맞는 크기) 자른 후, 숟가락 2개(핀셋)를 이용, 조심스럽게 홈에 넣는다. → 이때, 홈 보다 sample이 커서 gel 바깥으로 나오면 안된다 ∵ 번질수도 있기 때문에..

22. 0.8% Agarose를 준비하고, Gel과 Plug 사이의 빈 공간을 매운다. ⇒ Gel과 Plug사이의 빈공간을 없도록 하여, 다른 영향을 받지 않고 전기영동이 잘 될 수 있도록 하기 위함이며, 1%의 Agarose를 쓰지 않고, 0.8%의 Agarose를 쓴 이유는 넣는 도중에 혹시나 굳는 것을 방지하기 위해서이다.

23. Sample과 Marker를 다 넣었으면, 조심스럽게 gel과 Templete를 분리(gel 가장자리의 templete 제거)하여 TBE buffer가 들어있는 온도 setting이 끝난 준비된 gel box에 넣어준다.

24. 뚜껑을 닫고, pump switch를 다시 켜서 circulation 시켜주어 gel이 고정되었는지 확인한다.

25. CHEF MAPPER를 setting한다. ⇒ Gradient : 6.0 Angle : 60℃ Run time :26.40초 Initial switch time : 6.75초 Final switch time : 1분 33.69초 26. Run(Start)한다. ⇒ 시작 버튼을 누르면, Run time을 확인할 수 있다. Run time 확인 후, 시간에 맞추어 기기를 꺼야 한다. Pulsed field gel electrophoresis(PFGE) 미국에서 했던 실험중 하나.. 더 많은 참고를 원하시면, 아래 싸이트를 참고하세요~~!! *^^*

 

http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Cobain/method.html

http://www.bio-rad.com/cmc_upload/0/000/013/015/M1703729B.pdf

http://www.uga.edu/srel/DNA_Lab/PFGEindex.htm

http://www.lbm.fmvz.usp.br/VirtualVisit/PFG.html