Transformation by the electroporation procedure

< Preparation of the bacterial cells for electroporation >

  ☞ Competent cell 만들기

Meterials

LB plate, LB medium, kanamycin, strains, 20ml LB medium(in 100ml flask), plasmid DNA, gene pulser, cuvette, Ice bath, 10%(w/w)의 glycerol(cold condition), microtube, centrifuge, centrifuge tube, SOC medium(37℃), beaker, water bath(37℃)

Methods

1. LB plate와 LBA plate를 만든다.

   ⇒ LBA : kanamycin(50ug/ml)

2. 준비된 LB plate에 strain을 streaking하고, 24h동안 키운다.

3. 준비된 LB medium에 균주 colony 하나를 따서 medium에 접종하여 24h동안 키운다.

4. 배양된 균주용액에서 micropipette를 이용하여, 200ul를 따서 넣는다.

5. Shaking incubator에서 37℃, 150rpm의 조건으로 15 ~ 18h 정도 배양시킨다.

   (O.D value(600nm)가 A1.0~1.3의 값이 될 때까지  배양시켜준다.)

6. Ice bath를 준비하고 그 위에 microtube를 놓아둔다.

7. 배양된 박테리아를 micropipette를 이용하여 2ml를 취하여 microtube에 넣어주고, ice 위에 15분동안 정치시킨다.

6. 15분 후, 원심분리기를 이용하여 4℃의 조건에서 15분동안 3500g로 원심분리 해준다.

7. Supernatant(상층액)을 따라버리고, 준비된 10%의 glycerol을 1.5ml 넣어 gently하게 재현탁한다.

8. 6~7번을 3반복한다.

9. 2번 반복이 끝난 후, 마지막 3반복시에 700ul의 10%(w/w)의 glycerol을 넣어주고 현탁시켜준다.(최종 volume 1ml)

10. Electroporation에 사용하거나, -70℃에서 보관한다.

Electroporation protocol

1. Water bath의 물 온도를 37℃로 셋팅한 후, SOC medium를 37℃로 맞추어 놓는다.

2. Ice bath를 준비하고, Electroporation cuvettes과 1.5ml의 microcentrifuge tube를 준비하여 ice bath 위에 놓는다.

3. Plasmid와 electroporation-competent cell을 얼음 위에서 녹인 후, cell을 잘 섞어준다.

4. Micropipette를 이용하여 microtube에 1ul의 plsmid DNA를 넣어준다.

5. Micropipette를 이용하여 microtube에 competent cell 용액을 40ul 넣고 잘 섞어준다.

6. 잘 섞은 cell-DNA 혼합물을 차가운 electroporantion cuvette으로 옮긴다. 이 때, 혹시 cuvette안에 기포가 생길 수 있으므로 가볍게 두드려준다.

7. Gene Pulser(Bio-Rad)를 이용하여 Electroporation을 한다.

  ⇒ 25uF capacitor,

     초기 전압 : 10~25 kV사이(representing 5~12.5kV)

     Pulse controller unit(Bio-Rad) : 200A 또는 400A(각각 5ms와 10ms)

8. Electroporation을 한 후, 바로 cuvette를 꺼내어, cuvette 안에, 960ul의 SOC medium(37℃)을 넣어주고 cell을 잘 섞어준다.

9. Microtube를 준비하고, 잘 섞은 cell 용액을 tube로 옮긴 후, 37℃의 150 rpm의 조건으로 water bath에서 1시간동안 배양시켜준다.

10. LBA(LB-Antibiotic)를 준비하여 100ul의 배양된 cell을 넣고 도말한다.

11. 24~72 시간동안 37℃에서 배양시켜준다.

12. 배양 후, colony check.