Isolate DNA from Soil Sample & Concentrating the DNA

Isolate DNA from Soil Sample

 

< 실 험 준 비 물 >

   65 ℃의 Shaking water bath, Centrifuge tube, Pipette, vortex, Ice bath

 

1. Ultra Clean(Soil DNA Kit Mega Prep)을 준비하고, Kit를 점검한다

    ⇒ Sample의 양에 따라 Kit 크기가 달라진다.(본 실험은 큰 것을 예로..)

2. Shaking water bath에 물의 양과 온도를 확인한다

    ⇒ 물의 양은 50ml의 tube가 들어가서 incubation 시킬 수 있도록..

3. Sample을 준비하고, vortex 후, Kit 중, Mega Bead Tube에 pippette를 이용하여, 15 ml씩 따서

    넣어준다

4. vortex 기계를 이용하여 1 분간 세게 vortexing 시켜준다

5. S1 solution을 준비한다

    ⇒ S1 solution은 용액안에 침전물이 있을 경우가 있다. 확인 후, 만약 침전물이 있다면,

        열을 가해 녹여준다

6. Vortex가 끝나면, S1 solution 1.2 ml를 넣어준다

7. 30초간 vortex(vigorously)

8. Inhibitor Removal Solution(IRS) solution을 준비하여 vortex가 끝난 sample에 4 ml씩 넣어준다   

    ⇒ 이 과정은 PCR을 할 경우에만 행한다

9. 65 ℃의 Shaking water bath에 Maximum speed로 shaking 하면서 30분 동안 위치시킨다

10. 30 분 후에 5000 rpm으로 3 분간 centrifuge 시킨다

11. Supernatant(상등액)을 kit에서 제공된 new centrifuge tube에 넣는다

    ⇒ 아래에 있는 pricipitate가 함께 딸려 나올수 있으므로 홀피펫 등을 이용하여 조심스럽게

        상등액을 옮겨 담는다

12. S2 solution를 준비하고, 새 튜브에 2 ml씩 넣어준다

13. 뚜껑을 닫고 아래위로(invert) 2~3번 섞어준다

14. Ice bath를 준비하고, 그 위에서(4 ℃) 10 분동안 정치(incubation) 시켜준다

15. 시간 경과 후, 5000 rpm에서 4 분간 centrifuge 시킨다

16. Kit에서 제공된 new centrifuge tube를 준비하고, 11번과 같은 방법으로 상등액 을 조심스럽게

     옮긴다

17. 30 ml의 S3 solution을 넣고 13번과 같은 방법으로 섞어준다

18. Kit에서 제공된 Filter가 있는 tube를 준비하고 17번에서 섞어준 용액을 담아 5000 rpm에서

      2 분동안 centrifuge 시켜준다

     ⇒ Filter가 있는 tube에 sample이 한번에 다 들어갈 수 없으므로 양을 맞추어 나누어서 담고,

         2 분씩 centrifuge 해준다. centrifuge 후에 걸러진 용액은 비이커등에 따라 버리고, 다시

         sample을 넣고, centrifuge.. 이런 형식으로 행한다

      ※ filter와 tube가 분리되고, 실험을 하는 동안에 sample이 헷갈릴수도 있으므로, 라벨링을

          잘해주어야한다.

19. Sample의 centrifuge가 끝났으면 S4 solution을 6 ml씩 넣고 5000 rpm에서 3분 동안 centrifuge

     한다

20. centrifuge가 끝났으면, 아래로 빠진 용액을 버리고, 다시한번 centrifuge 한다

21. 원심분리 후, 조심스럽게 spin filter를 kit에서 제공된 새로운 튜브로 옮긴다.

22. 8 ml의 S5 solution을 넣고 3 분간 centrifuge 한다. ⇒ S5 solution은 따뜻한 상태에서 넣는게

     좋다

23. 원심분리가 끝나면, spin filter를 버리고, 용액이 담긴 tube는 -20 ℃에서 잘 보관한다.

 

 

Concentrating the DNA

 

< 실 험 준 비 >

   Sample DNA, 50mM TE buffer, centrifuge tube, %M Nacl, 100% ethanol, Tissue, Ice bath,  

   pipette, microtube

 

1. Sample DNA 8 ml와 5 M NaCl 0.32 ml, 16.6 ml의 100% cold ethanol을 넣고, 9000 g로 15분간

    centrifuge 한다

2. Centrifuge가 끝나면 꺼내기 전에 pellet이 모일 지점에 표시를 하고 조심스럽게 꺼내어 상등액을

    따라 버린다.

    ∵ DNA가 거의 보이지가 않는다. 따라서 표시를 하는게 더 나은 것 같다

3. Tissue를 준비하고, sample이 있는 tube를 거꾸로 엎어놓고 건조시킨다

4. 50 mM TE buffer와 Ice bath 위에 microtube를 준비한다

5. 50 mM TE buffer를 0.5 ml 넣고 resuspension시킨다

    ⇒ pipette를 이용하여 tube의 기벽과 바닥을 깨끗하게 씻고 잘 섞어준 후, microtube로 옮긴다 6. Labeling 확인 후, -20 ℃에서 보관한다