전기영동

Electrophoresis

 

1. Sample과 Reagent를 준비한다. ⇒ Sample, TAE(TBE) buffer, gel loading buffer, parafilm, Agarose, 전기영동장치 ☆ Gel loading buffer : 0.25% bromophenol blue 40%(w/v) sucrose in water ※ Gel loading buffer는 여러 가지가 있으나 이것을 사용 ☆ TAE buffer(Tris Acetate EDTA) 만들기 Tris-base 48.4g Glacial Acetic Acid 10.9g EDTA 2.92g D.W 1.0 L Jeounghyun Ryu ☆ Gel 만들기(1 ~ 1.2 %) : 삼각플라스크(100ml)에 Agarose 0.3g과 TAE buffer 30ml를 넣고 전자렌지를 이용하여 녹여준다. ※ Gel 만들때에 DNA의 크기가 큰 경우에는 gel의 농도를 약간 낮추어주고, DNA gene의 크기가 작은 경우에는 농도를 약간 높여준다.

2. 삼각플라스크에 Agarose와 TAE buffer를 넣고, 녹인후, gel tamplete에 넣고 굳힌다. 이 때, 검은 부분을 위로하여, comb을 꽂는다. 왜냐하면, 그래야 나중에 sample을 넣을 때에 확인이 용이하기 때문이다.

3. gel이 굳고 난 후, 조심스럽게 comb를 제거하고 gel을 전기영동장치에 넣어준 후, 알맞은 양의 TAE buffer를 넣는다. ※ comb을 뺄 때 잘못하면 gel이 찢어지는 수가 생기므로 주의해야 한다.

4. parafilm을 조금 잘라 그 위에 gel loading buffer를 sample의 개수만큼 1㎕씩 떨어뜨린다.

5. PCR을 끝낸 sample을 준비하고, 각각 5㎕씩 gel loading buffer위에 떨어뜨려 피펫을 이용, 잘 섞어준 후, comb 홈에 조심스럽게 넣는다.

6. DNA의 크기에 맞는 Marker를 선택하여 control로 이용한다. ⇒ marker는 비싸므로, 0.5㎕와 TAE buffer 5㎕, gel loading buffer 1㎕를 넣고, 섞어주어 전기영동한다.

7. sample과 control을 다 넣었으면, 50V의 전압으로 전기영동한다. ⇒ 100V로 했을 경우에는 열도 많이 나고, 전기영동의 bead가 휘어질 염려가 있으므로 보통 50V의 전류를 사용한다.

8. 전류는 (-)에서 (+)로 흐르므로 잘 확인하고 사용한다.

9. bend가 중간쯤, 혹은 중간보다 약간 넘었을 경우에 멈추어준다. ∵ 중간 정도 조금 지나서 stop 하였을때, buffer보다 조금 작은 것은 bend 아래에 나타날 것이요, bend보다 조금 무거운 것은 bend보다 조금 위에 나타날 것이다. 즉, 너무 오랜기간 running을 하면 DNA bend가 사라질 수가 있기 때문에 알맞게 하는 것이 가장 좋다.

10. 용기에 Ethidium bromide(Stain)와 증류수(Destain)를 준비한다. ⇒ Ethidium bromide는 유독성 물질이므로 gel을 넣을때나 꺼낼 때 장갑을 끼고 실험을 하며, gel을 넣을 때 떨어지거나 찢어지지 않도록 조심스럽게 넣어준다.

11. Ethidium bromide(Stain) 용액에 10 ~ 15분정도 담그고 난 후, Destain 용액으로 옮겨 20 ~ 30 분정도 담가 놓는다.

12. 시간이 다 지났으면 gel이 안 찢어지도록 잘 꺼내어 사진을 찍고 결과를 확인한다.