미생물의 보존

미생물의 보존

가. 목적

균주를 오염되지 아니하고, 변화나 변이 없이 최대한 본래의 분리된 상태를 순수하게 그대로 유지하는 것

미생물 균주를 보존하는데에는 많은 보존 방법들이 있으며, 그 중, 보존하려는 미생물에 알맞은 방법을 이용하여 균주를 보관한다.

나. 원리

미생물의 세포 내에 함유되어 있는 수분을 조절함과 동시에 이 수분들이 관여하여 일어나는 생체대사를 조절하기 위하여 환경을 조절하는 것.

1. 대사반응을 저하시키는 방법

  a. 저온유지: 계대 보존법

  b. 산소 제한: 파라핀 증층법

  c. 영양분 제한: 현탁 보존법

2. 수분을 한정시켜 대사반응을 정지시키는 방법

  a. 수분의 이동을 정지시키는 방법: 냉동 보존법

  b. 수분을 제거시키는 방법: 건조 보존법, 동결건조 보존법, 담체 보존법

※ Check Point

  a. 오랜기간 생존가능해야만 한다.

  b. 보존 중에 변이나 미생물의 형질변화가 없어야 한다.

  c. 적은 경비로써 보존이 가능하여야 한다.

  d. 보존 시료의 조제나 방법의 조작에 있어 간편해야 한다.

     즉, 여러단계를 거치기 보다는 짧은 시간에, 쉽고 짧은 과정으로 가면 좋고,

     용기나 조제시약에 있어서도 가능한 간편해야만 한다.

  e. 미생물의 보존시에 오염이 되지 않아야 하며, 반복사용이 가능해야 한다.

     그러나, 얼렸다 녹였다 하면, stock의 bioactivity가 떨어지므로, 3번 이상

     사용하는 것은 좋지 않다.

다. 미생물의 보존 방법

  1. 계대 보존법

a. 평판접시, 사면(slant), 천자(stab)를 사용하여 1-2개월에 한번씩 정기적으로 계대하여 냉장고 또는 실온에서 보관하는 단기 보존방법.

b. 배지는 탄수화물, 단백질 등 영양분이 풍부하지 않은 것을 사용.

c. 문제점: 유전적 변이가 일어나기 쉽고 작업이 많고 잡균 오염가능성이 크고 균주 착오가 일어나기 쉽다.

2. 파라핀 증충법

a. Cap tube 중에 사면배지, 천자배지에 살균된 파라핀을 중층하여 냉장 또는 실온보관

b. 계대보존법을 개선한 방법으로 산소를 제한하여 대사를 억제하고 수분 증발을 방지하여 장기간 보존 가능

3. 현탁 보존법

a. 세포 또는 포자를 유기 영양원이 함유되지 않은 완충액 등에 현탁

b. 곰팡이, 효모, 방선균 등 동결건조에 의하여 장기보존이 어려운 경우 사용

4. 담체 보존법

대부분의 균체는 건조시 사멸한다. 그러나 포자 형성 균주와 같은 특수한 경우에는 적당한 용제에 건조시켜 보존하면 대사기능이 정지되어 휴지 상태로 장기간 생존한다.

가. 토양 보존법

a. 토양을 건조한 후 2회 정도 살균한 후 무균검사를 하고 균액을 첨가한다.

b. 포자 형성 세균, 방선균, 곰팡이에 사용

나. 모래 보존법, silica gel 보존법

a. 바다모래를 산, 알칼리, 물로 잘 세척하여 건열 멸균을 한다.

b. 균 배양액을 넣고 모래와 잘 혼합하여 진공건조 후 상압에서 밀봉하여 보존한다.

5. 동결 건조법

a. 미생물의 장기보존 방법 중 가장 보편적인 방법

   (ATCC; American Type Culture Collection)

b. 균액조제

  ㄱ. 액체 배양 : 배양액을 원심분리하여 상등액은 버리고 분산매를 대신

                 채워서 균일한 균액을 얻는다.

  ㄴ. 고체 배양: 대수기를 지나 포자가 형성되면 분산매를 고체배지에 붓고

                 loop를 이용하여 긁어서 포자액을 얻는다.

c. 방법

  ㄱ. 조제된 균액을 미리 준비된 앰플에 주사기나 긴 모세관으로 연결된

      스포이드를 이용하여 넣고 앰플입구를 면전한다.

  ㄴ. Dry ice와 에탄올을 이용, 균액을 동결, 수분을 고정시킨다. (-78℃)

  ㄷ. 동결건조기를 진공 상태로한 후 앰플의 면전을 제거한 후, 앰플을 동

      결건조기에 연결시킨다.

  ㄹ. 진공건조를 한 후 burner를 이용하여 화염으로 봉하고 냉장고에 보존

      한다.

※ 분산매 : 동결 과정과 동결 후 건조과정에서 완충작용 및 보호작용을 한다.

            탈지유 10%, 탈지유 5%, 포도당 5%, 전분 20%

6. 냉동 보존법

a. 건조조건에서 생존율이 현저히 떨어지는 균, 포자 형성이 어려운 곰팡이,

   미세조류, 원생동물, 동식물세포, 적혈구, 암세포, 정자 등 보존에 사용.

b. 미생물의 적용범위, 생존기간, 형질의 안정성 등이 뛰어난 보존법.

c. 분산매: 20% glycerol, 10% dimethylsulfoxide, 탈지유, 혈청.

d. 보존온도.

1. -20℃ : 냉동고 (-20℃ 이상에서의 보존은 재결정화, 높은 염농도로 인한 용해 등 심한 피해 존재)

2. -70℃ : Deep freezer

3. -196℃ : 액체질소

e. 완만동결 : 급속히 동결시키면 세포내에 얼음 결정이 생겨 생존율이 저하

             될 수 있다.

7. 건조 보존법

a. 동결에 의한 장해를 받는 미생물에 사용 (NCIB 영국,IFO 일본)

b. 생존율이 좋고 장기보존이 가능; 갑작스러운 온도 하강으로 균사멸

   위험성 감소

c. 분산매와 균액제조 : 동결건조와 동일

8. 동결건조균의 복원

샘플 복원 시 앰플을 깨트리면, 급격히 공기가 앰플 속으로 들어가 건조균이 공중에 비산되거나, 공기중의 균에 의해 오염되는 위험이 있다. 그러므로 앰플을 줄이나 유리칼을 이용하여 홈을 만들고 70% 알코올을 뿌리고, 멸균된 가제로 앰플을 감싸서 끊어대거나, 홈을 낸 부분에 적열된 유리봉의 선단을 가볍게 접촉시켜 틈새를 만들어 그 사이로 공기가 서서히 들어가기를 기다린 후 끊는다.

솜 마개가 된 앰플은 마개 부위를 끊으면 공기가 솜 사이로 들어가므로 오염의 위험을 방지할 수 있다.

앰플 내의 소량의 배양액, 또는 적당한 복수액(0.3∼0.5㎖)을 서서히 가해 건조 균체를 잘 용해시켜 액체배지에 접종한다.

동시에 한천평판에 도말시켜 오염의 유무와 콜로니 형상을 확인하는 것이 좋다.

동결 건조균은 세포상해를 입을 수 있으므로 한천배지에서 생육이 되지 않는 경우가 있다.

이 때는 액체배양에서 생육된 균을 한천평판에 다시 숙주하여 배양한다.

동결보존의 기본 원리

동결과정에서 생길 수 있는 세포손상의 원인은 다음과 같다.

 1) 저온노출

  동결에 의해서가 아닌 낮은 온도에 노출됨으로 인해 세포내의 기관과 기능에 장애가 발생하는 것이다. 이 손상은 냉각 속도에 영향을 받는데 냉각속도가 빠를수록 손상이 커지는 것으로 알려져 있다. 이런 상황하에서 세포막 구조의 변화로 인한 반투과성의 변화가 발생할 수 있고 세포질의 수축이나 세포골격 요소의 응집등 형태학적 및 기능적 손상이 초래된다. 또한 uncoupling of respiration이나 carbohydrate conversion 대사과정의 손상 등 생화학적 생리적 변화가 발생한다.

 2) 얼음결정형성에 의한 기계적 및 물리적 영향

    세포가 동결배지 등에 현탁된 상태 즉 수용성 환경하에서 동결보존시 온도가 천천히 내려가면 먼저 세포외액이 동결되기 시작하며 세포는 냉각은 되었지만 아직 얼지 않은 상태로 세포외액의 얼음 결정내에 갇히게 된다. 온도가 계속 내려가면서 세포외액의 얼음 결정이 자라면 세포막이 기계적인 손상을 입을 수 있다. 얼음결정이 형성 될 때 얼음 결정 격자내의 전하를 띤 이온이 밖으로 빠져나와 세포외부의 잔존 액체에 축적되는데 이때 자라는 얼음 결정과 세포외액사이의 접촉영역에 전기장이 발생하고 (Workman-Reynolds effect) 세포막과 접촉시 전위차가 일정 수준을 넘게되면 세포막이 파괴되게 된다. 세포내 얼음결정은 각종 세포내 기관에 치명적인 손상을 입힌다. 동결 속도를 천천히 내리면 세포내액이 세포밖으로 충분히 유출되면서 세포내 얼음결정 형성 시간이 지연되고 얼음결정이 형성되더라도 육각형 얼음결정보다 크기가 작은 입방체를 이루게되며 입방체 얼음결정은 세포내기관에 큰 손상을 입히지 않는 것으로 알려져 있다.

3) 세포외액 & 세포내액 조성의 변화

셋째, 넷째도 역시 동결 속도를 천천히 할 때 발생하는 것으로 먼저 세포외액이 동결되기 시작하고 얼음 결정 격자내의 용매가 밖으로 빠져나와 잔존 액체에 축적되어 세포외액이 고장액으로 변하게 된다. 이로인한 세포막 내외의 삼투압 차이가 일정 수준을 벗어나면 세포막이 손상받을 수 있고 그보다는 삼투압차이가 적은 경우 세포질내의 수분이 세포외액으로 빠져나가 세포내외의 삼투압이 평형을 이루게 되면 세포내는 탈수 현상이 발생한다. 탈수 현상으로 세포질 내외는 고장액으로 변하게 되어 이로 인한 삼투압 스트레스가 세포에 손상을 초래한다. 또한 세포내 부피가 줄면서 세포막이 쭈그러 드는데 이 경우에도 세포막의 손상이 발생할 수 있고 세포외액의 점도 변화나 pH 변화도 세포에 나쁜 영향을 줄 수 있다.

세포동결 용기(Cryovial)

세포동결 용기로서 1-1.8ml의 플라스틱 바이알을 가장 많이 사용한다. 용기의 부피가 커질 경우 동결배지에 현탁된 세포가 균질하지 않게 분포하게 되므로 작은 부피의 시료를 보관하는 것이 안전하다.

▷ 밀봉나사가 외부에 있는 것 ; 오염방지에 유리하나 내부로 액체질소가 유입될 경우 해동시 폭발 위험이 더 크다.

▷ 밀봉나사가 내부에 있는 것 ; 밀봉고무가 존재하므로 바이알의 밀봉상태가 더 안전하다. 그러나 동결전 밀봉고무가 젖어있을 경우 온도변화에 의한 팽창, 수축으로 오염될 위험이 있으므로 취급시 특별히 조심해야한다. 

동결보호제

세포동결보존시 발생하는 손상으로부터 세포를 보호하기위한 또 하나의 방법이 동결보호제(cryoprotectants)를 동결배지에 넣어주는 것이다. 동결보호제의 역할은 세포외액에 얼음 결정이 형성될 때 발생하는 삼투압 스트레스로 인한 세포 손상을 막아주고 세포에 치명적인 세포내 얼음 결정 형성을 억제하는데 있다.

▷ 동결보호제의 특징

1)세포막에 투과정이 좋아서 세포내로 들어가 지나친 동결건조를 예방하고 농축된 세포질내의 세포기관이나 생물학적으로 중요한 분자를 보호할 수 있어야하며 세포내 얼음 결정형성을 방지할 수 있다.

2)세포에 독성이 적어야한다.

3)용해도가 좋아야한다.

▷ 동결보호제의 종류

DMSO(dimethyl sulfoxide), glycerol, 1,2-propane-diol, sufrose, methanol, glucose, proline, galactose, lactose, glycine betaine, fructose 등이 있는데 DMSO나 glycerol을 가장 흔하게 사용한다.

동결세포농도

세포의 동결-해동 과정에서 세포 생존율에 영향을 주는 또 다른 요인은 동결시키는 세포의 농도이다. 적혈구의 경우 세포농도가 높을수로 해동시 용혈 현상이 잘 일어나는 것으로 알려져 있으며 다른 종류의 세포에서도 cytocrit가 증가할수록 세포 생존율이 떨어지는 것으로 보고되고 있다. 세포손상이 일어나는 cytocrit의 한계치는 대략 20% 정도인데 말초혈액 간세포(peripheral blood stem cell)의 경우 6×10^8cell/ml이 이에 해당되며 각질형성세포의 경우는 1×10^8cell/ml이 해당된다. 실제 동결보존을 할 경우는 2-5×106cell/ml로 동결시킨다.

동결세포의 해동

해동 과정에서도 동결과정에서와 마찬가지의 기계적, 화학적, 물리적 영향을 받게 되는데 두 과정의 차이점은 처음 시작하는 세포의 상태에 있다. 동결과정의 경우 충분히 수화된 세포가 주변환경과 평형을 이룬 상태에서 자작하지만 해동 과정의 경우 동결건조상태이거나 세포내 얼음 결정이 존재하는 상태에서 자작하게 된다. 만약 해동과정이 천천히 이루어진다면 세포외액부터 세포내로 수분이 유입되면서 세포내의 얼음 재결정화(recrystalization)현상이 발생하게 된다. 즉 해동시 전체 얼음의 양은 감소하지만 재결정화 현상이 발생하며 이것은 세포에 치명적인 손상을 입히게 된다. 따라서 해동과정을 최대한 신속히 진행하여야 해동 후 세포 생존율이 증가할 수 있다. 일반적으로 액체질소 용기에서 동결바이알을 37℃ 수조로 옮겨 1분내에 해동시킨다(1200℃/min).

해동속도는 액체질소에서 37℃ 수조로 동결바이알을 옮기는 방법으로 최대한 신속히 진행하여야(1200℃/min) 최대의 세포생존율을 얻을 수 있다.

생세포 counting (dye exclusion)

세포 현탁액을 만들었을 때 살아있는 세포(생세포)와 죽은 세포의 비율(생세포율), 혹은 살아있는 세포만의 수를 알고 싶은 경우가 있다. 생세포를 구별하는데 자주 사용되는 것으로  trypan blue를 이용한 색소배제법이 있다. trypan blue에 의해 푸르게 염색되어 있는 세포를 죽은 세포로 구분하여 counting한다. 살아있는 세포도 시간이 경과함에 따라 점차로 염색되기 때문에, trypan blue용액을 첨가하여 즉시 계산판에 넣어 계산한다.

원칙적으로 세포분열하는 세포 즉 증식성 세포를 동결보존해야한다. 동결보존시 원칙적으로 세포분열하는 세포 즉 증식성 세포를 사용하여야 하며 동결전 세포의 성장상태는 log phase(지수성장기)가 좋으므로 계대뱡양을 시행한지 2-4일 후 세포의 종류에 따라 적절한 시기에 동결보존 해야한다.