Transformation

Transformation by the calcium chloride procedure

 

< 실험 하루전 >

1. 동결건조된 E-coil를 LB 배지에 접종하여 37℃의 shaking incubater에서 incubation시켜준다. ⇒ E-coli는 chromosomal DNA만 있는 것을 사용(예 : DH5α)

2. Sterile solution을 만든다. ⇒ CaCl2 50mM, Tris․Cl 10mM(pH 8.0) 예> ☞ 500ml를 만들려면, 50mM CaCl2 495ml와 1M의 Tris․Cl 5ml를 섞는다. 그리고 나서 Autoclave

3. Ampiciling stock을 만든다. ⇒ 25 ㎎/㎖ 4. LBA 배지를 만들어 plate를 만든다. ⇒ LB배지에 Ampicilin을 넣어 만든다.(50㎍/㎖) 예> 250㎖의 LB 배지가 있다면, 250 × 50㎍ = 12500㎍ = 12.5㎎ 따라서, Clean bench안에서 0.5㎖의 Ampicilin stock을 넣어준 후, 잘 섞어주고 plate에 pour한다.

 

< 실험 당일 > plasmid와 sterile solution, Ice bath, 홀피펫을 준비한다.

 

3. 전날 배양한 E-coil를 다시 새로운 LB배지 100ml에 1ml 접종하고 incubation 시켜준다.(아침 9시) Jeounghyun Ryu ⇒ 보통 E-coli는 1:100 또는 1:200 으로 많이 접종을 하며, 이 과정은 Stationary phase cell을 다시 키워 exponential cell을 얻기 위한 과정이다. 왜냐하면 exponential phase cell을 competent cell로 만들기 쉽기 때문이다.

4. 4~5시간 배양 후, Cell을 원심분리 해준다.(4000g, 5min)

5. 원심분리 하는 동안 ICE bath를 준비하고 차가운 sterile solution과 microtube를 준비한다.

6. 원심분리가 끝나면, supernatant를 따라내고, ice bath에 놓은 후, sterile solution 60ml 넣고 섞어준다.

7. Ice 위에서 15분동안 놓아둔 후, 다시 원심분리한다.(4000g, 5min)

8. 원심분리가 끝나면 처음양의 1/15양의 sterile solution을 넣고 잘 섞어준 후, 0.2ml를 취하여 microtube에 넣어준다.

9. 준비된 plasmid를 40ng(즉, 아주 극소량)을 microtube에 넣어준 후, 잘 섞어준다. ⇒ 이 때에는 vortex, 혹은 세게 흔들어주면 안된다. 즉, 살짝 톡 치는 식으로 하여 잘 섞어준다. ∵ 이 과정은 plasmid가 DNA에 붙게하는 과정인데, 세게 흔들어주면 잘 붙질 못할수도 있다.

10. Ice bath에서 30분간 놓아둔다.

11. water bath로 옮겨 42℃에서 2분간 열을 가해준다. ☞ Heat shock

12. 2분이 지나면, 꺼내어 Ice bath위에서 10초정도 놓아둔 후, LB 배지 1ml를 넣고 잘 섞어준다.

13. 37℃ incubator에서 1시간정도 incubation 시켜준다.

14. Incubation이 끝나면, 준비된 LBA배지에 접종, 도말한다.(10㎕, 20㎕, 50㎕)

15. Incubator에서 incubation 시킨다.